HPVの存在証明⑦病原体の単離・分離とはなにか

①結核患者のサンプル中に結核菌がいることを見つけた。

これがまずコッホがやったことで『特殊な染色法』を開発して、結核患者のサンプル中に必ず含まれる『新しい病原体・細菌（結核菌）』を発見しました。

②純粋培養をおこなって、結核菌だけが含まれるサンプルを作った。その方法を純粋培養という。

それまでも、細菌が液体培地で増えることはわかっていました。液体培地の問題点は、液体中で増えてくる細菌は自由に動き回ることができるので、最初のサンプルに複数の細菌が含まれていた場合（かならず2種類以上の細菌が含まれると考える方が自然です）、液体培地中で増えてくる細菌は2種類以上になります。

いずれにせよ、混ざり物から始まった液体培地中のサンプルには病原体が複数種類入っていると考えられます（批判できます）ので、このサンプルをもちいて感染実験を行なっても、特定（一種類）の病原体と病気の因果関係を示すことができません。

そこでコッホが開発したのが固形培地🐰

ポイント①は、液体培地と違って流動性がなく、かき混ぜるのでなければ、細菌は固形培地上を動くことができません。固形培地上で増殖した細菌はそこに留まり続けます。

ポイント②は、元のサンプルを十分希釈して播種した場合、固形培地上に形成される細菌のコロニーは『単一の』細菌から増えてきたと考えることができます。

これで、このサンプル(コロニー）には単一(一種類)の病原体しか含まれていないということができましたね🐰一個の細菌から増えてきたのだから、一種類に決まっています。

いい指摘ですね🐰

そこで、コッホはこのプロセスを何回も繰り返します

この様に、単一の細菌から増えてきたと推定できる作業を、複数回繰り返すことによって

この様なことが起こったであろう可能性がどんどん小さくなって、最終的に『合理的な疑いの範囲を超えて（好きなフレーズです）』このサンプルには一種類の病原体しか入っていないということができる様になります。

これが、病原体の単離・単離された病原体という意味です。どの様にして一種類の病原体しか含まれないと言えるかのプロセスとロジックが単離ということになります。

このサンプルを使って感染実験をすれば、結核菌が結核の原因になったと証明することができます。で、されたわけです。19世紀の終わりの話なのですが、保健機関は行政文書として保持・提出しないのはなぜでしょう。

一つの病原体をサンプル中から分離してそれを見せたり、感染実験をすることはできません。一つの細菌・細胞ですからね。そのため、必ず『増殖させる必要』があります。一つの病原体から増殖させることによって、単離されたことが担保されたわけです。

サンプル中に含まれるたくさんの細胞を固形培地中で『分離』して、一つの細胞から『増殖してきた』コロニーを形成させる。『一つの細菌細胞から増殖』ですよ🐰

増殖させないと単離できないのですよ、理論上。

無理なのはわかりますね。いくら多くの同じ病原体が含まれたサンプルであろうと、複数の病原体が含まれているものがから精製したのでは、

この批判に反論することができません。単離は『一つの細菌細胞から増殖』これがポイントです。

次にウイルスの代表例としてコロナウイルスでみてみましょう（🐰さんも「普通の風邪の原因になっているコロナウイルス』を用いてやったことがありますよ）。

ここでも『一つのウイルスから増殖』させることが単離の条件になります。

基本的には結核菌でやってきたことと同じです。何やりましたっけ？

『一つの病原体から増殖したサンプルを作製』ですね🐰

ウイルスは自分自身では増殖することができずに、必ず細胞に感染・寄生してその細胞の中でのみ増えることができます。『その増殖に生きた細胞が必要であること』がウイルスが持つ性質です。そのため、

単離するためには『一つのウイルスから増殖したサンプルを作製』する必要がありますから、

①細胞を用いた培養増殖系が必要で

②その様な細胞に一つのウイルスを感染させる必要がある。

ということになります。

これもナンセンスです🐰単離のためには『必ず』ウイルスを増殖させる必要がありますから、細胞がないと増殖しないウイルスの単離を細胞培養増殖系を使わずに行うことは不可能になります。微生物学上の単離の概念がわかっているなら言えることではありません🐰

簡単で🐰さんが通常行う方法は『限界希釈法』です。TAKARAのページにちょうどいいのがありました。

これは左から『元のサンプルを10倍ずつ希釈していったもの』をそれぞれのウエル(細胞が培養されている区画、この図では96区画ある）に感染させる実験の概念図です🐰

左ほどたくさん（の種類の）ウイルスが含まれていて、右にいくほど少なくなっていきます（薄めていくわけですから）。そして、十分に希釈されると(結核の時と同じです）、一つのウエルに、1個ウイルスしか存在しないことが必ず発生します。そして、そのウエル内で一つのウイルスは細胞に感染し増殖することになります（結果、細胞変性として確認されます）。

この図では、８列目の二つの細胞変性したウエルでは（白抜き）、一つのウイルスが最初含まれていて、そこから増えてきたと解釈できるわけです。

『サンプル中に単独の(一種類の）病原体・微生物が含まれないことを単離された病原体とする』わけですから、そうなりますよね🐰つまり、『ウイルスが単離された』ということです。

え？

では、同じことを繰り返しましょう🐰

この様に繰り返すことによって、最終的に『合理的な疑いの範囲を超えて（好きなフレーズです）』このサンプルには一種類のウイルスしか入っていないということができる様になります。

この様にしてウイルスの単離ができました🐰

純度でもありませんし、ウイルスだけを取り出すことでもありません、手技自体でもありません（再度）どの様にしてサンプル中に一種類の病原体しか含まれないと言えるかのプロセスとロジックが単離かどうかです。

対照実験は『具体的な反論』に対して行われるものです。

病原体の単離実験においてウイルスや細菌は『1個の細菌・ウイルスから増殖したもの』になります。増殖したものということはたくさんあるということです。

ウイルスで言えば、

『1個のウイルスを感染させた細胞から、同じ様に細胞に感染することができる・細胞変性を起こすことができるもの（ウイルスなんですが）が大量に産生』されてきます。

１つのウイルス・病気(細胞変性)を起こすことができる因子が、無数に増殖するわけです。そんな毒性物質が(化学的な意味での物質として）ありますか？

ウイルス（や細菌）であればできます。ウイルスは単なる毒性物質ではなく『増殖性の病毒素』ということができます。

で、これに対する『具体的な反論』とはどの様なもので、どの様な対象実験が必要ですか？

B型肝炎ウイルスとB型肝炎の因果関係は単離されたウイルスと感染実験ではなく、他の方法（血清学的手法）を用いて示されたました（こちら）。画像で引用する

蛋白質を指標にその病原体を『単離することなし』に病気との因果関係を示したために、サンプル中に『その病毒素以外の関係はあるが未知の何か』があるかもしれないと条件がつくわけですね（後に他のエビデンスで解消されましたが）。

サイトメガロウイルスと伝染性単核球症においても同じ様な条件がついていました。

病原体を単離・分離するということはどういうことか、微生物学上の単離の意味について説明しました。感染研が発表した『新型コロナウイルスの分離・単離に成功』もこの様な手順を用いて、サンプルが一種類の新型コロナウイルスからなることを示すことによって『単離・分離』したわけです。

混ざり物からコロナウイルスを分けたので『分離』といい、一種類のウイルスしか含まれていないことを示したので『単離』になるわけですね。

さて、HPVは単離できるのでしょうか？HPVには細胞増殖系がないことを考えると単離は難しそうですが🐰

『さて、準備は整いしまたです』（アーニャ）

次回以降（ようやく）HPVがどの様に発見され、どの様な病原体であるか・たくさんの種類があること、それらがどの様に区別され・その性質がわかっていくのかについて話を進めていくことにします。